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東方肝膽外科醫院:氫鹽水對肝切除術后肝功能保護研究

作者:admin  來源:未知  更新時間:2017-06-29 17:51:18
作者:東方肝膽外科醫院博士研究生李東宇,導師楊廣順教授
對于原發性肝癌及肝轉移瘤患者來說,肝切除術是經典且有效的治療手段,可以顯著改善患者的預后,但同時也為患者帶來了圍手術期風險。相對于局部肝切除術而言,行擴大肝切除術的患者術后并發癥的發病率和死亡率均較高,而有慢性肝病的患者手術風險更高。但是,隨著對肝臟解剖認識的不斷加深、外科技術的進步和圍手術期監護水平的提高,擴大肝切除的手術指征在拓展,并且也取得了一定的效果。盡管如此,行擴大肝切除術后仍不可避免的會出現一些嚴重的并發癥,肝功能衰竭就是其中之一,其死亡率高達70-80%。擴大肝切除術對肝功能的損傷包括了物理損失和缺血再灌注損傷,如何對接受擴大肝切除術的患者進行有效的肝功能保護是臨床上比較重視和關心的問題。
針對缺血再灌注損傷機制,目前研究證實有保護作用的藥物主要分為:自由基清除劑、鈣離子拮抗劑、炎性細胞因子抑制劑、微循環改善藥物等。近年來,氫氣抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用逐漸被廣大學者所重視,大量的實驗證據表明,氫氣可以通過對抗氧自由基,減輕ROS系統對細胞的損傷,減少細胞凋亡,從而有效地保護細胞,具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用。本課題中,我們將首先建立豬70%擴大肝切除模型,并評價其安全性及臨床模擬性;然后將在確認氫生理鹽水對豬擴大肝切除術后肝臟功能的保護作用的基礎上,通過測定幾種炎性細胞因子水平、幾種凋亡相關蛋白活性及轉錄因子水平等,以進一步探討氫生理鹽水在對豬擴大肝切除術后肝功能的保護作用方面亞細胞水平及信號轉導途徑的機制。
第一部分、豬70%擴大肝切除模型的建立
目的:建立豬70%擴大肝切除模型,并評估其安全性及臨床模擬性。
材料和方法:6只巴馬小型豬,體重在25.30kg,在全麻條件下行70%肝臟切除術,術中給予全肝門阻斷。監測術中生命體征情況,記錄術后7天存活率,檢測術前及術后第1、2、3、5、7天的肝功能(TBIL、ALE、AST)及血紅蛋白(HGB)變化。
結果:術中生命體征平穩,術后7天存活率100%,無嚴重并發癥。術后TBIL顯著升高(P<0.05),術后第3天到達峰值,之后逐步恢復。ALT,AST在術后5日內升高顯著(P<0.05),術后第1日達到峰值,之后逐步恢復。監測血常規HGB未見明顯貧血改變。
結論:豬70%擴大肝切除模型安全穩定,具有較好的臨床模擬性,可用于擴大肝切除術后肝損傷的研究。
第二部分、氫生理鹽水對豬擴大肝切除術后肝功能的保護作用及機制研究。
目的:研究氫生理鹽水對豬擴大肝切除術后肝功能的保護作用,并從抗氧化、抗炎、
抗凋亡及肝再生等方面探討其相關機制。一
材料和方法:12只巴馬小型豬,體重在25.30蠔,隨機分為70%肝切除+生理鹽水對照組(Ns組,n=6)和70%肝切除+氫生理鹽水實驗組(H2組,n=6),均在全麻條件下行70%肝臟切除術。氫生理鹽水干預方案:行擴大肝切除術,并給予全肝門阻斷。解除肝門阻斷后即經胃網膜右靜脈置管,給予氫生理鹽水250ml靜滴,之后術后第1、2、3d均經胃網膜右靜脈給予氫生理鹽水250ml。NS組以等量生理鹽水作為對照。觀察兩組的7d生存率,術前及術后第1、2、3、5、7天的肝功能(TBIL、ALT,AST)及血常規(WBC、HGB)變化。術后第7d處死動物,觀察其肝臟病理改變(光鏡及電鏡),用相應的檢測試劑盒分別測定肝組織中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD),過氧化氫酶(CAT)含量。用ELISA法檢測IL.6、TNF.a、IL.1 13等炎性因子的血清水平,用Real—timePCR法檢測肝組織中炎癥信號相關分子P65的mRNA水平的變化。免疫組化p65染色觀察肝組織炎性改變,ki67染色觀察肝細胞增殖情況。用Western Blot法測定BCL-2、PARP等凋亡相關蛋白的表達水平,用Western Blot法測定p65、IKBa、IKK Q、IKK 13等分子的表達水平。
結果:
1、7d生存率:兩組在體重、手術時間、肝門阻斷時間、麻醉時間、術中失血量等方面的差異無統計學意義。兩組的7d生存率均為100%。
2、肝功能及血常規變化:與NS組相比,H2組TBIL術后第1至7d均顯著下降,TBIL同樣在術后第3d達到峰值,但峰值顯著下降;與Ns組相比,H2組ALT,AST在術后第1至7d均顯著下降,同樣在術后第1日達到峰值,但峰值顯著下降。
3、光鏡下病理改變:NS組術后7d可見肝細胞變性并伴有炎性細胞浸潤,肝竇內皮剝脫、肝竇結構紊亂,匯管區門靜脈內皮損傷等均較明顯:與NS組相比,H2組術后7d肝細胞腫脹、變性較輕,門管區靜脈內皮損傷不明顯,肝小葉結構無明顯紊亂。
4、電鏡下超微結構改變:NS組術后7d可見細胞核固縮反應,并可見凋亡小體形成,線粒體出現空泡,線粒體膜擴張、嵴消失,胞漿內空泡形成,。與NS組相比,H2組術后7d細胞結構基本完整,未見明顯染色質聚集,線粒體改變不明顯,未見明顯凋亡小體:
5、肝組織氧化應激的檢測:與Ns組相比,H2術后可見組織MDA含量明顯降低,SOD及CAT含量明顯升高。
6、血清中IL-6、TNF-a、IL.1 13等炎性因子的變化:與NS組相比,H2組IL.6、TNFa、IL.1 13表達水平明顯降低(P 7、免疫組化染色:p65染色顯示,與Ns組相比,H2組術后7天p65胞漿著色減弱,提示炎性反應可能減輕。ki67染色顯示,與Ns組相比,H2組術后7天ki67染色陽性染色細胞計數明顯增加,提示肝細胞增殖能力較強。
8、肝組織中p65分子mRNA水平的變化:與Ns組相比,H2組p65分子mRNA表達水平明顯降低(P 9、BCL.2、Cleaved PARP等凋亡相關蛋白的表達水平:與Ns組相比,H2組肝組織中Bcl.2抑凋亡蛋白表達水平上調,Cleaved PARP的表達水平降低。
10、肝組織p65、IKB Q、IKK Q、IKK 13等炎性轉導分子的表達水平:與Ns組相比,H2組p65表達明顯減少,而IKB Q的表達明顯增加。IKK Q、IKK13的表達水平無明顯變化。
結論:
l、氫生理鹽水可有效減輕擴大肝切除術后的肝細胞損傷,促進肝細胞增殖;
2、氫生理鹽水可以減輕缺血再灌注時氧自由基對組織的損傷;
3、氫生理鹽水通過抑制NF.KB信號轉導通路抑制了炎癥因子的表達,減輕了肝臟組織的炎癥反應;
4、氫生理鹽水可有效抑制細胞凋亡。

東方肝膽外科醫院從事氫氣醫學效應研究的課題組包括吳老、王紅陽院士關于肝硬化保護,俞偉峰主任關于氫氣對抗疼痛,楊廣順教授關于肝臟手術損傷保護,周偉平教授關于膽管淤積肝硬化。上述研究氫思語都先后進行了介紹。今天介紹的是楊教授課題組關于肝臟大部分切除后肝臟保護的實驗研究。

楊廣順院長介紹


  楊廣順,男,1952年1月出生,安徽人,1988年畢業于第二軍醫大學肝膽外科專業,獲醫學博士學位,曾于2000年赴約翰·霍普金斯大學醫學院進修。現任東方肝膽外科教授,主任醫師,博士生導師,膽道二科主任,兼任全軍肝膽外科專業委員會主任委員、上海市普外學會副主任委員等多個學術任職。楊廣順教授擅長肝膽腫瘤的診治和肝移植。科研主攻方向:原發性肝癌的臨床診治,原發性肝癌復發機制研究,肝移植的基礎與臨床研究。曾承擔上海市發展基金重大課題《肝癌的標準化治療方案研究》和國家自然科學基金等4項課題,發表論文62篇,參編專著12部。先后獲上海市醫學科技一等獎、軍隊醫療成果二等獎、上海市科技進步二等獎等6項獎勵。于1996年入圍上海衛生系統首批“百人計劃”,楊廣順2012年榮獲“中國名醫百強榜”上榜名醫。






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